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Estudio de hemocromatosis hereditaria en población laboral
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Autores:
F. Gómez-Gallego (1) , C. Santiago (1) , M. C. Salido (1) , L. Chicharro (1) , I. López-Abadía (2) , M. J. Martín (3) y F. Bandrés (1)
(1) Laboratorio de Biopatología. Dpto de Toxicología y Legislación Sanitaria. Facultad de Medicina. Universidad Complutense de Madrid.
(2) Dpto. de Especialidades médico-quirúrgicas. Facultad de Medicina. Universidad del País Vasco.
(3) Mutua Vizcaya Industrial. |
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Resumen:
La hemocromatosis hereditaria (HH) es una enfermedad genética caracterizada por una acumulación progresiva de hierro en diferentes órganos como consecuencia de una elevada absorción de éste. El diagnóstico clínico de la HH está basado en la evaluación de los niveles séricos de hierro, ferritina, transferrina e índice de saturación de transferrina. En el presente estudio se realiza un análisis comparativo entre estos parámetros bioquímicos y la presencia de las mutaciones C282Y y H63D en el gen HFE asociadas a HH en una muestra de población laboral. |
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Palabras clave:
Hemocromatosis hereditaria, hierro, ferritina, transferrina, índice de saturación de transferrina. |
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Abstract:
Hereditary haemochromatosis (HH) is a genetic disorder resulting in a lifelong increased iron overload. The clinical diagnosis of HH is based in the analysis of values of serum iron, ferritin, transferrin and transferrin saturartion. The aim of the present study was carry out a comparative analysis between these measured biochemical parameters and the presence of C282Y and H63D mutations in the HFE gene associated to HH in a sample of worker population. |
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Key words:
Hereditary haemochromatosis, iron, ferritin, transferrin, transferrin saturation |
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Introducción:
La hemocromatosis hereditaria (HH) es una enfermedad genética de transmisión autosómica recesiva caracterizada por una absorción intestinal elevada de hierro debido a una alteración en su metabolismo [1]. Se la considera una enfermedad potencialmente grave por las lesiones celulares que se producen en diversos órganos como consecuencia de la acumulación de este metal [2-4] . Un diagnóstico rápido puede evitar daños importantes en hígado, corazón, piel, articulaciones o páncreas; y con un tratamiento temprano con flebotomías impedir que la enfermedad desemboque en cirrosis, cardiopatías, diabetes mellitus y otras lesiones irreversibles [1,5] . Es por tanto fundamental encontrar un método clínico que facilite el diagnóstico de la HH.
Desde un punto de vista bioquímico, niveles de hierro superiores a 150 m g/ml 6 y de ferritina en suero superiores a 280 m g/ml en hombres y 140 m g/ml en mujeres 7 respectivamente, así como una elevación del índice de saturación de transferrina (IST) por encima del 45% [8] , permiten considerar si se está frente a un paciente con HH. El problema reside en que estas determinaciones no son diagnósticas de la enfermedad y que para confirmar las sospechas habría que repetirlas pasado un tiempo y someter al paciente a una biopsia hepática [9] . Teniendo en cuenta que no siempre se puede realizar dicha biopsia y que el tratamiento mediante sangrías no es tolerado por sujetos que no cursen HH [7] , se discuten otros métodos para el diagnóstico de la enfermedad.
En 1935 Sheldon [10] sugiere que la hemocromatosis es una enfermedad hereditaria y en 1976 Simon et al [11] apuntan la asociación de la enfermedad al locus HLA, pero es en 1996 cuando Feder y sus colaboradores [12] identifican un gen candidato para la hemocromatosis llamado HFE localizado en el brazo corto del cromosoma 6, y relacionan dicha enfermedad con dos mutaciones específicas en la mayoría de los pacientes europeos [9,12] . La mutación mayoritaria, una sustitución de cisteína por tirosina en la posición 282 (C282Y), en estado homocigoto en un paciente con clínica de hemocromatosis confirma su diagnóstico [7,12,13]. La presencia de la segunda mutación, una sustitución de histidina por aspártico en la posición 63 (H63D) tiene un papel más controvertido [12,13] , pero en estado heterocigoto combinado con la mutación C282Y también se ha encontrado con frecuencia en los enfermos de HH [14-16].
Atendiendo a que la HH tiene una prevalencia de 1:20 en heterocigosis y 1:500 en homocigosis en población Caucásica [17] y basándonos primero en que la saturación de la transferrina es más sensible para detectar precozmente una sobrecarga de hierro por hemocromatosis que la ferritina [18] , y segundo que el análisis genético de las dos mutaciones descritas es diagnóstico en un porcentaje muy alto de los pacientes con HH, se realizó el siguiente estudio: en un colectivo de 100 individuos se analizaron las mutaciones genéticas H63D y C282Y del gen HFE asociadas a HH. A continuación se eligieron aquellas muestras en las que se encontró alguna de las dos mutaciones, en heterocigosis u homocigosis, y se determinaron los niveles de hierro (Fe), ferritina (Frt) y transferrina (Trf) en suero y se calculó el índice de saturación de transferrina (IST) correspondiente a cada individuo con el fin de establecer una correlación entre éste y la presencia de alguna de las mutaciones. |
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Materiales y métodos:
Pacientes: Se analizaron las mutaciones H63D y C282Y del gen HFE en un colectivo de 100 individuos varones anónimos que acuden a reconocimiento médico laboral entre los meses de abril y junio de 2001 con edades comprendidas entre 21 y 61 años. En las muestras positivas para alguna de las mutaciones se determinaron posteriormente los niveles de hierro, ferrtina y transferrina en suero.
Determinaciones bioquímicas: Los niveles de hierro se determinaron a partir de suero mediante un ensayo colorimétrico de Roche en un analizador Hitachi 704.
Los niveles de ferritina y transferrina en suero se detectaron por medio de inmunonefelometría con partículas intensificadoras en un sistema BNA de Dade Behrinng.
El cálculo del IST se realizó a partir de los valores de hierro y transferrina séricos empleando la siguiente formula:
IST(%) = (Fe sérico (ug/ml).100)/(Trf sérica (mg/dl).1,27)
Análisis genético: Para la detección de las mutaciones se extrajo el DNA genómico de sangre periférica anticoagulada con EDTA con el método clásico del fenol/cloroformo y posterior precipitación alcohólica. Posteriormente, se amplificaron mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) las zonas a estudiar con cebadores específicos 14 que delimitan los codones donde se localizan las mutaciones. Las condiciones de PCR fueron las siguientes para ambas mutaciones: desnaturalización inicial 95 ºC 5 min; 35 ciclos de 95 ºC 1 min, 55 ºC 45 seg, 72 ºC 1 min; extensión final 72 ºC 5 min. Posteriormente, los productos de PCR obtenidos se sometieron a una digestión enzimática con endonucleasas de restricción que cortan el DNA en sitios concretos y permiten determinar la presencia o ausencia de las mutaciones. Las enzimas de restricción utilizadas fueron: SnaB I para la detección de la mutación 845 G ® A (C282Y) y Bcl I para la detección de la mutación 187 C ® G (H63D). Los resultados del proceso de digestión se visualizaron en geles de agarosa al 2% teñidos con bromuro de etidio (Figura 1).
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Fig 1: Gel de agarosa al 2% teñido con bromuro de etidio. Las flechas, muestran de arriba abajo, los fragmentos generados tras las digestiones con Bcl I y SnaB I : 420, 300, 220, 160 y 120 pb. Las muestras aplicadas corresponden a: M . Marcador de peso molecular (Ladder 100); 1. H63D (-/-); 2. H63D (-/+); 3. H63D (+/+); 4. C282Y (-/-); 5. C282Y (-/+).
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Resultados y discusión:
Los resultados obtenidos a partir del análisis genético de las mutaciones H63D y C282Y del gen HFE mostraron que la presencia de la sustitución H63D en heterocigosis se presentaba en el 35 % de los individuos mientras que en un 2 % aparecía en homocigosis. La mutación C282Y se detectó en heterocigosis en el 5 % de los sujetos mientras que en estado de homocigosis no se observó en ningún individuo. En dos de estos sujetos analizados se detectó la presencia de ambas mutaciones en heterocigosis (Tabla I).
Las determinaciones bioquímicas de niveles de hierro, transferrina y ferritina en suero realizadas posteriormente en aquellas muestras positivas para la presencia de alguna mutación mostraron que únicamente un 20 % de ellas correspondieron a muestras con valores de IST superiores al 45 %.
Desde un punto de vista clínico, el primer indicio que puede hacer sospechar de la presencia de un cuadro de HH es la alteración de algún parámetro asociado al metabolismo del hierro, principalmente una elevación del IST por encima del 45 % o un aumento de la ferritina sérica por encima de los 300 m g/ml. Sin embargo, en esta situación es conveniente repetir las determinaciones pasado algún tiempo debido a las limitaciones que presenta esta tecnología, propias del tipo de muestra empleada, habida cuenta de las modificaciones que se pueden producir en estos parámetros en función de la dieta, la hora del día, el posible consumo de suplementos férricos y los efectos asociados al desarrollo de algunas patologías, como por ejemplo determinados procesos inflamatorios [18].
En el presente estudio se muestra como del total de muestras en las que se detectaron la presencia de alguna de las dos mutaciones genéticas analizadas únicamente un 20 % cursaron con valores de IST superiores al 45 %. En un 15 % se determinaron niveles de ferritina superiores a los valores de referencia, aunque está descrito que este parámetro no es muy específico ya que sus niveles se pueden elevar igualmente en otro tipo de patologías [8] . Debido a que el hierro se acumula en los diferentes órganos de forma progresiva durante la vida de los pacientes, los resultados obtenidos dan idea de la dificultad de efectuar un diagnóstico clínico, en el que la principal consecuencia es que en una proporción muy elevada de individuos no es posible diagnosticar la enfermedad en una etapa temprana debido a que ésta puede cursar durante gran parte de la vida del individuo de forma asintomática.
Desde un punto de vista genético, los resultados obtenidos confirman los valores de prevalencia de ambas mutaciones en población española determinados en otros estudios [15] . En el presente trabajo se muestra que dentro del grupo de individuos con alguna mutación genética en el gen HFE, la proporción de individuos con alteraciones en algún parámetro asociado al metabolismo del hierro es pequeña, indicando una discordancia entre ambas aproximaciones experimentales. Adicionalmente, se observa que la proporción de sujetos heterocigotos para la mutación H63D es netamente mayor que la de cualquiera de las otras situaciones. Desde un punto de vista clínico, estos individuos son únicamente portadores de la enfermedad, debido al carácter recesivo de la HH, aunque es importante no desestimar esta situación ya que en la actualidad todavía son necesarios estudios adicionales que ayuden a comprender mejor este hecho al nivel de la función biológica de la proteína sin olvidar la posible asociación a otras mutaciones genéticas diferentes que puedan provocar el desarrollo de la enfermedad [16].
Como conclusión se puede mencionar que esta aparente discrepancia entre los resultados bioquímicos y genéticos sugiere la posibilidad de considerar las ventajas que desde un punto de vista de vigilancia de la salud puede representar la realización de la detección genética de las mutaciones en los diagnósticos de HH, sobre todo en las fases tempranas de la misma cuando ésta cursa de forma asintomática. Además de la utilidad meramente clínica, la realización de este análisis genético permitiría la identificación de familiares potencialmente afectos de alguna mutación y de individuos homocigotos sin síntomas en población general. De igual forma, unos valores bioquímicos alterados en pacientes sin estas mutaciones genéticas supone un gran estímulo en la búsqueda e identificación de nuevas mutaciones en el gen HFE o en otros involucrados en los fenómenos de absorción de hierro. |
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Table 1: Frecuencias génicas de las mutaciones H63D y C282Y en la población analizada
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C282Y(-/+) |
C282Y(+/+) |
| H63D (-/-) |
60 |
3 |
0 |
| H63D (-/-) |
33 |
2 |
0 |
| H63D (-/-) |
2 |
0 |
0 |
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Bibliografía:
- Bacon, B. R.; Tavill, A. S. Hemochromatosis and the iron overload syndromes. En: Zakim D. Boyer TD, editores. Hepatology: a textbook of liver disease. Filadelfia: WB Saunders, 1996; 1.439-1.472.
- Bothwell, T. H.; Charlton, R. W.; Motulsky, A. G. Haemochromatosis. En: Scriver et al. editores. The metabolic and biochemical basis of inherited disease (7ª ed.) 1996; 2237-2269.
- Oliva, R.; Bruguera, M.; Sánchez, M.; Rodés, J. Hemocromatosis hereditaria: utilidad clínica del diagnóstico genético molecular. Medicina Integral 1999; 33: 416-425.
- Pardo, A.; Salido, E.; Quintero, E. Hemocromatosis hereditaria: implicaciones clínicas del diagnóstico genético. Gastroenterol Hepatol 1999; 22: 415-428.
- Edwards, C. Q.; Griffin , L. M.; Golgard, D.; et al. Prevalence of hemocromatosis among 11.065 presumably healthy blood donors. N Engl J Med 1988; 318: 1355-1362.
- Vives Corrons, J. L.; Aguilar Bascompte, J. L. En Manual de Técnicas de laboratorio en hematología. (2ª ed.) Editorial Masson S. A. 1997.
- Oliva, R.; Sánchez, M.; Bruguera, M.; Rodés J. Utilidad clínica de la detección de mutaciones del gen HFE en la hemocromatosis. Gastroenterol Hepatol 2000; 23: 433-435.
- Adams, P.; Brissot, P.; Powell, L. W. EASL International Consensus Conference on Haemochromatosis. J Hepatol 2000; 33: 485-504.
- Kowdley, K.; Trainer, T. D.; Saltzman, J. R.; et al. Utility of hepatic index in American patiens with hereditary hemocromatosis. Gastroenterology 1997; 113: 1270-1277.
- Sheldon, J. H. Haemocromatosis. London : Oxford University Press, 1935.
- Simon, M.; Bourel, M.; Fauchet, R.; Genetet, B. Association of HLA-B14 antigens with idiopatic hemochromatosis. Gut 1976; 17: 332-334.
- Feder, J. N.; Gnirke, A.; Thomas, W.; Tsuchihashi, Z.; Ruddy, D. A.; Basava, A.; et al. A novel MHC class I-like gene is mutated in patients with hereditary haemocromatosis. Nat Genet 1996; 13: 399-408.
- Bacon, B. R. Diagnosis and management of hemochromatosis. Gastroenterology 1997; 113: 995-999.
- Beutler, E.; Gelbart, T.; West, C.; et al. Mutation analysis in hereditary hemochromatosis. Blood Cells Mol Dis 1996; 22: 187-194.
- Sánchez, M.; Bruguera, M.; Bosch, J.; Rodés, J.; Ballesta, F.; Oliva, R. Prevalence of the HFE Cys282Tyr and His63Asp gene mutations in Spanish patients with hereditary hemochromatosis and in controls. J. Hepatol 1998; 12:451-453.
- Aguilar Martinez, P.; Biron, C.; Blanc, F.; Masmejean, C.; Jeanjean, P.; Michel, H.; Schved, J. F. Compound heterozygotes for hemochromatosis gene mutations: may they help to understand the pathophysiology of the disease? Blood Cells Mol Dis 1997; 23:269-276.
- Gottschalk, R.; Seidi, C.; Löffer, T.; Seifried, E.; Hoelzer, D.; Kaltwasser, J. P. HFE codon 63/282 (H63D/C282Y) dimorphism in German patients with genetic hemochromatosis. Tissue Antigens 1998; 51: 270-275.
- Fábrega, E.; Castro, B.; Sánchez-Castro, L.; Benito A.; Fernández-Luna, J. L.; Pons-Romero, F. Prevalencia de la mutación Cys282Tyr del gen de la hemocromatosis en Cantabria y en los pacientes diagnosticados de hemocromatosis hereditaria. Med. Clin. 1999; 112: 451:453.
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